图1：梯度洗脱中使用的流动相程序（实线）以及在色谱柱入口段观测到的流动相组成（虚线）。两者的差异是由从溶剂混合处到柱入口之间的路径造成的。
再平衡对色谱柱来说意味着什么？
我们对梯度洗脱条件下色谱柱的平衡的研究最早来自21世纪初与Adam Schellinger以及Peter Carr教授在明尼苏达大学的工作。在发现洗脱时间的重要性之后，我们很快意识到我们需要区分两种不同程度的色谱柱再平衡：
充分再平衡（Full re-equilibration）：这个名词指色谱柱达到一种无论怎么增加再平衡时间也不会影响接下来的梯度洗脱分析方法中分析物的保留时间的状态。换句话说，我们能认为这是一种色谱柱用初始流动相冲洗到真正平衡的状态。
部分、可重现的再平衡（Partial, repeatable re-equilibration）：这个名词的意思是色谱柱虽然没有用初始流动相达到充分的平衡，但是这个再平衡时间可以保证分离过程中得到高度的可重现性。
了解这两种再平衡的区别非常重要，因为：1）达到充分的平衡会消耗非常长的时间（有些情况需要数小时）；2）在很多情况下，获得一个有用的分析结果并不需要色谱柱的充分再平衡。在这些情况下，分析的高重现性（如用保留时间的准确度来衡量）比色谱柱的充分再平衡更重要，如果可以通过减少再平衡时间来缩短分析时间，那就能够显著提高分析通量、降低分析成本。
总结前面关于梯度方法时反相色谱柱的再平衡的大量详细的研究工作，我们可以得出以下两个结论：
在tflush后的1-2个柱体积的平衡后有可能获得具有优秀重现性的梯度分析结果；
充分的平衡过程会被几个因素影响，比如缓冲液的浓度、pH值，特别是对于离子型分析物。
第一个结论非常引人注意，因为当时主流的观点认为在梯度方法中需要至少用10个柱体积的起始流动相冲洗色谱柱。如果我们考虑到可以节约2-10个柱体积的冲洗时间，这就非常可观了。比如说，典型的150 x 4.6 mm的色谱柱的柱体积是1.5 mL，如果我们的流速是2 mL/min，那么当我们从原方法的10个柱体积减少8个柱体积时，我们每次进样可以节约6 min。
我们做的这些研究工作的出发点是更好地了解二维液相色谱（2D-LC）的平衡需要多少时间。这种进一步的了解确实促进了二维液相色谱的广泛使用，因为发现第二维的色谱柱的平衡仅仅需要数秒的时间，相当于仅使用起始流动相冲洗一个左右的柱体积。
HILIC分离的情况又会咋样呢？
在过去数年里，有很多关于HILIC柱再平衡速度的讨论。最近，David McCalley通过详实的实验来说明在梯度洗脱方法中HILIC分离的再平衡与反相分离相比没有那么大的差异。也就是说，HILIC分离的高重现性甚至可以在相对短的时间的再平衡后获得。然而，HILIC固定相的充分的再平衡需要花费非常长的时间（比如几十分钟或者几个小时）。McCalley在这些研究中用过的最短的平衡时间是4.3 min。
我们最近实验发现在使用更短的再平衡时间时依然可以获得令人满意的HILIC分离结果。在我们的研究中，我们考察了再平衡时间对分析物的保留时间和保留重现性的影响，实验涉及到六款不同的固定相、三种不同的流动相pH、不同的缓冲液浓度以及中性和离子型化合物。在一些情况下，我们只需要用3秒的再平衡时间（在再平衡时间超过了实验中的tflush的前提下）。
会讲故事的色谱图
图2展示了我们在HILIC柱再平衡时的一系列色谱图。这里需要强调的是这些色谱图是通过一种非常规配置的仪器实现的，这种配置就是为了这个研究而专门设计的，它有两个特征：1）我们可以精确控制梯度分离之间的再平衡时间（可以到10 ms），2）梯度延迟体积很小（大约70 μL），但是最大流速对于分析柱来说还是足够大（5 mL/min）。对这些细节感兴趣的读者朋友可以去阅读呈现这些结果的文献（参考文献10）。图2是平衡时间为0.3到15 min时所得到的色谱图，通过这些图谱我们看到再平衡时间的改变对保留时间的影响是非常小的，特别是平衡时间在2.5-15 min的范围内时。对于苯海拉明（diphenhydramine）（第二个峰）最明显的变化发生在当再平衡时间从0.63 min降低到0.30 min的时候。我们看到苯海拉明的保留时间在降低再平衡时间的时候保留时间会稍微延长，从而导致苯海拉明和苯甲酸（benzoic acid）的分离度会有轻微降低。很显然，了解这种分离度与再平衡时间的关系很重要，如果在方法开发中发现这种情况，我们就可以把再平衡时间延长到1.3 min以避免这种敏感性对分析结果造成影响。
图2：再平衡时间对小分子亲水化合物用HILIC柱梯度洗脱结果的影响（0.30，0.63，1.3，5.0，10和15 min）。再平衡时间为15 min时三个重复试验的色谱柱叠加在一起来展示一个给定再平衡时间是的准确性。其中色谱柱为AdvanceBio Glycan Mapping (50 x 2.1-mm i.d., 2.7-µm)；梯度为0-1.5 min,95%-80% B。流动相A为100 mM乙酸铵（乙酸调节至pH 6.0）,流动相B为乙腈；柱温35℃，流速1.2 mL/min。分析物为：1) acenaphthene，2) diphenhydramine，3) benzoic acid，4) cytosine，5) 5-methylcytidine，6) normetanephrine。
更多的数据在图3中展示出来。在这里，我们已经绘制出了每个分析物在使用了不同的再平衡时间时的保留时间的差异。也就是说，这个图展示给我们哪些化合物在减少再平衡时间时保留增强，哪些化合物在减少再平衡时间时保留减弱。我们看到当绝大多数的分析物的保留和再平衡时间只有微弱的关系，苯海拉明在再平衡时间缩短时保留明显增加。再平衡时间对5-甲基胞苷（5-methylcytidine）和苯甲酸（benzoic acid）的保留有一定的影响，但是并不足以影响这些分析物和它们相邻峰的分离度。
图3：和图2相同的分离的实验整理出来的保留时间和再平衡时间的关系图
如上面所述，我们在再平衡这个主题上的绝大多数的工作都是通过这种非常规的仪器来实现的，以保证进样之间以及梯度洗脱循环的时间的精准控制。这些结果与二维液相色谱（2D-LC）直接相关，因为二维分离是通过两个分离之间精准的时间控制来实现的，然而由于在分析之间的数据处理和其他设备初始化步骤让使用者对时间的控制更弱，因此有一个问题是进样之间的平衡时间的变化是如何影响HILIC方法的可重现的保留的。为了评估这个，我们搭建了一个常规的液相仪器来做类似图2的分离实验，但是使用的柱子更长，分析时间也更长以获得更典型的分析结果。我们接下来连续做了40个HILIC分离实验，用的分析物和图2的一致，方法程序中再平衡的时间仅设置为30 s，也就是相当于这些条件下的两个柱体积。如图4为40个分离的保留时间的标准偏差，这个实验结果非常明确地显示在常用的仪器中，只使用两个柱体积的再平衡就可以获得具有高度重现性的HILIC梯度分析数据，当然前提是再平衡时间比tflush更长。
图4：对6个组分混合物的HILIC梯度分离的保留时间的重现性。色谱条件——仪器：Agilent 1290 UHPLC双泵洗脱；色谱柱：AdvanceBio Glycan Mapping (150 mm x 2.1mm i.d., 2.7-µm)；梯度：0-6.0-6.01-6.5 min，95-85-95-95 %B；流动相A是100mM乙酸铵（用乙酸把pH调到6），B相为乙腈；温度35℃；流速0.6 mL/min。
结论
我们发现在梯度方法中即使没有用起始流动相将色谱柱冲洗到真正的平衡状态，也能获得具有好的重现性的色谱结果——即使是使用常规的液相仪器进行HILIC模式分析。当然在一些情况下，非常短的再平衡时间不能得到令人满意的结果，因此我们建议再平衡时间在方法开发过程中应该被系统地考察以更好地理解它对保留和分离度的影响。正如以前John Dolan在关于这个问题的讨论中很明智地指出，稍微过度的平衡比平衡不够充分要好得多。然而，显著减少再平衡时间也是提高样品分析通量、降低分析成本的一种潜在的有效方式。
内容来源：药物分析之家
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